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L’analisi del TOC nella Valutazione
della Contaminazione Organica
nelle Acque per l’Industria Farmaceutica

dr. Franco Ricci


Sommario
L’analisi del Carbonio Organico Totale, introdotta ufficialmente nelle norme USP, è oggi l’unica determinazione ammessa dalla Farmacopea Statunitense per la valutazione delle contaminazioni organiche dell’"Aqua Purificata"/(Purified Water) e dell’" Aqua ad injectabilia"/(Water for Injection).
L’uso di questo parametro, anche nella valutazione della "Cross–Contamination" nel "Cleaning Validation", sta incontrando sempre maggiori favori.
Scopo del presente lavoro è quello di mettere in evidenza alcuni aspetti analitici dell’analisi del TOC e dell’attuale strumentazione deputata a questo tipo d’analisi, anche al di fuori della matrice acquosa costituita dalla Purified Water.

Introduzione
L’Acqua è la più importante materia prima nell’Industria Farmaceutica. La sua qualità è di basilare importanza per la "qualità" stessa della specialità farmaceutica finale.

Possiamo ricondurre a quattro i tipi d’acqua base nell’industria farmaceutica [Fig. 1]: Acqua di pozzo o superficiale, tal quale, senza importanza alcuna per il processo di produzione. Essa è utilizzata esclusivamente per i servizi, come ad esempio per l’impianto antincendio. Ad un gradino di qualità superiore troviamo l’acqua potabile, proveniente dagli impianti di potabilizzazione, con diversi gradi di durezza, ma con ben precisi limiti di contenuto microbico. Questo tipo d’acqua può essere utilizzato per molti processi di pulizia e i primi stadi di risciacquo. L’"Aqua Purificata" (PW) è il grado successivo di qualità dell’acqua e può essere ottenuta dall’acqua potabile mediante cicli di trattamento atti a rimuovere i composti organici e inorganici in essa presenti. Questo terzo tipo d’acqua può essere utilizzato nelle produzioni di tipo "bulk batch", formulazioni di prodotti per uso non parenterale e come acqua di processo in tutti gli usi in cui questo tipo d’acqua può essere adoperato [1]. L’acqua di livello qualitativo più critico è l’ "Acqua ad injectabilia" (WFI), che è necessaria per i dosaggi di tutte le forme iniettabili e il risciacquo finale delle attrezzature, poi utilizzate per formulazioni in ambito parenterale. La materia prima in questo caso è l’acqua potabile o la Purified Water [2]. Dal 15 di Maggio del 1998, ufficialmente la USP ammette, come unica determinazione delle contaminazioni organiche nella PW e nella WFI, l’analisi del TOC.

 

 

Validazione del Cleaning
Le procedure di pulizia degli impianti, che debbono essere eseguite in occasione di un cambio di produzione in un impianto farmaceutico, richiedono particolari considerazioni, sia dal punto di vista analitico, che di processo. La validazione delle procedure di pulizia spesso deve prendere in considerazione la potenziale presenza di una miriade di composti organici come proteine, acidi nucleici, carboidrati, endotossine e, oltre ai principi attivi delle singole specialità medicinali, non ultimi i detergenti. La determinazione qualitativa e quantitativa, di ciò che spesso si presenta come una pletora di sostanze, diventa il vero "collo di bottiglia" delle procedure d’analisi. E’ perciò molto interessante poter disporre di metodi analitici in grado di misurare un vasto spettro di composti organici. Poiché è necessario poter dimostrare l’assenza di residui ( o per meglio dire presenza a livello di tracce ) nella fase di studio del Cleaning Validation, ogni metodo analitico deve avere, per convenzione, un limite quantitativo applicabile nell’intervallo da 1 a 10 ppm. Questo limite, oltre ai normali requisiti d’accuratezza e precisione, diventa un’imposizione "critica", per un metodo in grado di misurare un ampio spettro d’impurità e contaminanti [3].
L’attuale tecnologia ha permesso di realizzare analizzatori di TOC per il controllo in linea e in laboratorio, alcuni ideali per rilevare nelle acque ultrapure le basse concentrazioni, poche ppb, di Carbonio Organico, altri invece atti a determinare più alte concentrazioni della sostanza organica in matrici acquose soprattutto saline, altri ancora, in grado, con opportune precauzioni, di soddisfare entrambe le necessità [4-12], [15]. Molto spesso, questa complessità di matrici acquose e l’ampio spettro di concentrazioni possibili sono proprio lo scenario in cui si deve operare per il controllo delle operazioni di cleaning nei reattori.

Il TOC nella Validazione del Cleaning
Nella Validazione dei sistemi di pulizia, attualmente sono due i metodi che utilizzano la determinazione del TOC, la tecnica "Swab" e la tecnica "Rinse Water" [12].
Nella tecnica Swab, un bastoncino, con ad un’estremità un batuffolo d’opportuna fibra, viene sfregato sull’area ben definita, che deve essere campionata. Questa superficie può trovarsi sulle pareti del reattore, che è stato in precedenza pulito, oppure le pareti di un piccolo pannello (coupon) che, dopo essere stato immerso nel prodotto precedentemente formulato, è stato sospeso all’interno del reattore e di questo ne ha subito tutte le operazioni di lavaggio e risciacquo. Tutti i residui raccolti dallo swab sono poi estratti, inserendo il bastoncino in una provetta contenente una soluzione acquosa acidificata, che viene poi omogeneizzata prima di determinarne il TOC. Nell’altra tecnica "Rinse Water", si effettua l’analisi dell’acqua utilizzata per il risciacquo finale delle attrezzature, prima di iniziare la produzione della formulazione farmaceutica. Il raffronto tra il primo contenuto di TOC e quello dell’acqua proveniente dall’ultimo risciacquo, in ordine di tempo, determina il grado di pulizia raggiunto dalle attrezzature.
Indipendentemente dalla correttezza della determinazione del TOC (effetti matrice, sensibilità dello strumento, ecc) occorre ovviamente accertarsi che la tecnica utilizzata, Swab o Rinse Water, dia tutte le garanzie necessarie a che il processo di pulizia sia in grado di rimuovere efficacemente dalle superfici delle attrezzature i residui del prodotto e che il campionamento sia realmente rappresentativo [12].

Il TOC: parametro Globale Aspecifico.
Il TOC non da’ informazioni sulla tossicità del campione. Esso è un parametro chimico Globale Aspecifico. Globale: perché è la misura del contenuto di tutto il Carbonio della sostanza organica disciolta e non disciolta, presente nell’acqua. Aspecifico: perché non da’ informazioni sulla natura della sostanza organica [4]. Esso, tuttavia, permette di determinare il contenuto di carbonio organico, in concreto, in tutte le matrici acquose ed in particolare: nell’Acqua Ultrapura, nell’acqua di falda, potabile, di superficie, di mare e di scarico [4-12]. Com’è stato ricordato in precedenza, nelle procedure di pulizia i tipi d’acqua utilizzati dai primi lavaggi, per giungere fino agli ultimi risciacqui, vanno dall’acqua potabile alla PW, o addirittura in alcuni casi alla WFI.

 Considerazioni sui metodi di misura del TOC
Prima di determinarne il TOC (NPOC), è necessario che tutto il carbonio inorganico sia rimosso tramite purging del campione acidificato con un gas privo di CO2 e di composti organici. In alternativa è possibile determinare il Carbonio Totale (TC) e il Carbonio Inorganico (TIC) e calcolare il contenuto di Carbonio Organico Totale (TOC), sottraendo il TIC al TC. Questo metodo è indicato soprattutto per campioni il cui contenuto in Carbonio Inorganico è inferiore al TOC. Sostanze purgabili, come cicloesano o cloroformio, possono in parte perdersi con lo strippaggio. In presenza di queste sostanze la concentrazione di TOC va determinata separatamente o può essere applicato il metodo per differenza (TC – TIC). Con il metodo per differenza, il valore del TOC deve essere maggiore del TIC od almeno dello stesso ordine di grandezza [4].

 Definizioni
La quantità totale di Carbonio in un campione d’acqua è definita come Carbonio Totale (TC). Il Carbonio Totale è la somma di due specie di Carbonio.
Il Carbonio Inorganico totale (TIC) e il Carbonio Organico Totale (TOC). Il TIC esiste nel campione acquoso come CO2 disciolta o ioni dell’acido Carbonico.
TC = TOC + TIC
Il TOC può essere definito non come "cos’è", ma piuttosto com’è determinato:
Per differenza:
TOC = TC - TIC
Come somma del Carbonio Organico Purgabile (POC) e del Carbonio Organico Non Purgabile (NPOC).
TOC = POC + NPOC ( se il POC è trascurabile => TOC = NPOC )
Il TOC ancora può essere espresso come somma del Carbonio Organico Disciolto (DOC) e del Carbonio Organico in Sospensione (SOC)
TOC = DOC + SOC [12]

 Misura del TOC (TC – TIC)
Il TOC è determinato, analizzando separatamente su due aliquote dello stesso campione, il TC e il TIC. Il TC è determinato misurando lo sviluppo di CO2, proveniente dall’ossidazione di tutto il Carbonio presente nella prima aliquota di campione, mediante un opportuno detector. La determinazione del TIC si ottiene dalla misura della CO2 che si sviluppa per effetto dell’acidificazione della seconda aliquota di campione. L’abbassamento del pH nel campione, determina la trasformazione degli ioni dell’acido Carbonico in CO2 disciolta, che viene a sua volta "purgata" dalla soluzione e rivelata dal detector.

Misura del TOC (NPOC)
Prima di determinare il TOC (NPOC) occorre che il campione sia acidificato per trasformare gli ioni dell’acido carbonico in CO2 disciolta. Essa viene "purgata" dalla soluzione acquosa (e rivelata, se previsto nell’analizzatore, da un opportuno detector che permette di determinare il TIC). Dopo la rimozione di tutto il Carbonio inorganico, il Carbonio organico contenuto nel campione pretrattato viene ossidato a CO2, che viene poi rilevata dal detector. La massa del gas è proporzionale al contenuto di TOC (NPOC) del campione.

Tecniche di Ossidazione
Le tecniche attualmente utilizzate sono: Combustione Ossidazione chimica per via umida.

Combustione. Nella tecnica di combustione il Carbonio presente nel campione è bruciato in un’atmosfera contenente Ossigeno a 680-950 °C e trasformato in CO2, che poi è rivelata da un detector a infrarossi non dispersivo (NDIR) [Fig.2]. Il catalizzatore fornisce una grande superficie di contatto ad alta temperatura, che cede calore durante il processo di combustione delle sostanze contenute nel campione e aiuta il processo di ossidazione. Soprattutto i sali disciolti nel campione possono "sporcare" il catalizzatore durante la combustione, diminuendo l’efficienza del catalizzatore stesso. Se si abbassa la temperatura di combustione in presenza del catalizzatore, questi effetti negativi vengono superati. Esistono due tecniche di combustione: una a "bassa" temperatura (680°C), specifica per matrici saline come l’acqua di mare, l’altra "canonica" ad alta temperatura (800-950 °C). La Combustione offre come vantaggi: 1) alte percentuali di recupero del Carbonio organico di sostanze difficili da ossidare. 2) tempo d’analisi di 3/6 minuti. Alti livelli di concentrazione raggiungibili senza difficoltà (anche 10.000 ppm di C). Al contrario ha come svantaggi: 1) il volume limitato di campione, iniettabile direttamente nel tubo di combustione (a 680-950° C non più di 250/300 µl), che comporta limitazioni alla misura nel range 50-100 ppb[13]. 2) a seconda della temperatura di combustione, il catalizzatore si può sporcare con i sali presenti nella matrice 3) effetti di carry-over dovuti alla massa del catalizzatore stesso.
UV/Persolfato – Al campione viene aggiunto Persolfato (Sodio, Potassio, Ammonio) in una camera di reazione irradiata con raggi UV. La sostanza organica si trasforma in CO2, che è rivelata da un detector NDIR o a conducibilità. [Fig 3]
Persolfato a 100°C – Il Persolfato (preferibilmente di Sodio) è addizionato al campione in una camera di reazione che è scaldata a 95-100°C. Il Carbonio Organico del campione si trasforma in CO2, che è rivelata da un detector NDIR [Fig.4].
Solo UV. La sostanza organica disciolta nel campione viene convertita in CO2 in presenza di radiazione UV. La variazione della conducibilità prodotta dalla CO2 permette di risalire al TOC. L’eventuale presenza di Biossido di Titanio supportato sugli elettrodi, serve a catalizzare la reazione d’ossidazione. [Fig 5]

L’ossidazione per via umida presenta come vantaggi: 1) Il volume dei campioni, che può essere anche di 10 ml, o in alcuni casi anche 25 ml., permette di analizzare i campioni d’acqua ai bassi range (1-2 ppb di Carbonio) [13]. 2) a seconda del tipo di tecnica e di detector, permette di analizzare campioni contenenti sostanze emulsionate, colloidi, particolato in sospensione. L’ossidazione per via umida presenta invece come svantaggi: 1) tempo d’analisi più lento (6-15minuti). 2) Ad alte concentrazioni il TOC diventa difficile da analizzare[13].

Tecniche di Rilevazione

I tipi di detector utilizzabili sugli analizzatori di TOC sono diversi; prevalentemente le case costruttrici ne adottano due: il detector ad infrarossi non dispersivo e a conducibilità. Alla tecnica di combustione è generalmente accoppiato un rivelatore NDIR. Con gli analizzatori, che utilizzano l’ossidazione per via umida, possiamo trovare sia rivelatori NDIR, sia a conducibilità. Il detector NDIR è specifico per rilevare la sola CO2 e non è soggetto a interferenze dovute alla presenza d’altri gas. Soltanto il vapor acqueo interferisce nella misura della CO2 e per questo motivo si evita che possa giungere al detector. Il principio di rivelazione del detector a conducibilità è legato alla variazione di conducibilità dovuta allo sviluppo di CO2 in un campione acquoso. Questo tipo di detector, se abbinato a strumenti "dedicati", permette di rilevare concentrazioni di TOC, in acque Ultrapure per usi speciali nell’industria elettronica [16], addirittura inferiori al centesimo di ppb. Tuttavia esso non è specifico nei confronti della CO2, ma risente di tutte le eventuali interferenze dovute a composti ionici presenti nel campione, o che si vengono a formare come sottoprodotti del processo di ossidazione (Cl2, SOx, NOx, ecc). Anche l’uso di membrane (statisticamente) permeabili soltanto alla CO2, diminuiscono, ma non eliminano, questo tipo di interferenza, allorché le concentrazioni di eteroatomi* nel campione d’acqua da analizzare diventano significative. Analogamente accade se nel campione d’acqua c’è presenza di Ozono (utilizzato come agente sanitizzante), la cui molecola O3, ha un ingombro sterico simile a quello della CO2 [14]. Questo problema, in realtà, non si pone alle basse concentrazioni, tipiche delle UPW. Tuttavia, esso deve essere preso in considerazione, ad esempio nel controllo della Cross-contamination, qualora le matrici da analizzare siano complesse, ad alto contenuto di TIC, di sali (ad es. residui di soluzioni fisiologiche), ecc.

 TOC on-line e in laboratorio
L’analisi del TOC può essere condotta sia con analizzatori on line, che con unità da laboratorio
L’analisi del TOC in linea permette indubbi vantaggi quali:

Al contrario l’analisi on-line richiede il posizionamento di più unità e quindi maggiori investimenti.
Caratteristiche peculiari dell’analizzatore di TOC in linea sono: la semplicità d’uso, una minima manutenzione e, ove possibile, non utilizzare né reattivi (ad eccezione degli standard), né gas. Analizzatori di questo tipo sono quelli per acque ultrapure, che impiegano la tecnica d’ossidazione per via umida mediante l’uso di radiazione UV e detector a conducibilità.

L’analisi del TOC in laboratorio in generale presenta vantaggi come:

Al contrario l’analisi in laboratorio non permette un controllo a feed back del processo e la gestione dell’analizzatore di TOC da laboratorio personale qualificato ed infine necessita di reattivi e gas.

 

Un analizzatore di TOC (che si possa definire realmente da laboratorio) deve soddisfare alle Good Laboratory Practice (GLP) memorizzare dati e curve, aver possibilità di rielaborarli, permettere calcoli statistici, ecc. Nella determinazione del TOC (NPOC), è molto importante, se l’analizzatore di TOC in presenza di matrici contenenti ioni dell’acido carbonico o CO2 disciolta (acque potabili, di osmosi inversa) da’ modo all’analista,di controllare direttamente l’allontanamento di tutta la CO2 inorganica dopo acidificazione e purging. Ciò permette in pratica di rendere minimo, a piacere, l’errore sulla determinazione del Carbonio Organico [4], anche in presenza di alte concentrazioni di TIC. E’ stata preparata una tavola riassuntiva [tav.A] che può essere d’aiuto ad identificare, a seconda dell’uso finale e sulla base delle performance chieste all’analizzatore di TOC, la tecnica d’ossidazione abbinata al detector più opportuno.

Conclusioni
L’uso dell’analisi del TOC è entrato nel controllo delle acque ultrapure grazie alla USP, che di recente, come abbiamo visto, con questo test, ha ufficialmente sostituito il vecchio Test delle Sostanze Ossidabili (OST). Inoltre l’interesse per la determinazione del contenuto di Carbonio Organico Totale dei campioni nelle acque prodotte negli impianti farmaceutici, può non essere limitato alla concentrazione di poche decine di ppb tipiche delle UPW, ma può raggiungere le decine di ppm e oltre, come nel caso di campioni provenienti dallo Swab o dal Rinse Test. E’ facile pronosticare che, proprio grazie alla sua flessibilità, l’analisi del TOC acquisterà una sempre maggior presenza ed importanza come aiuto nelle pratiche di controllo dell’industria farmaceutica.

Bibliografia

[1] Ute Hangleiter-Water for the PharmaceuticalIndustry-(BIOforum Int’1/98)[2] Carleton,F.J.,P.Agallocco: Validation of Aseptic PharProcesses,(10.Digit MarcelDekker, NewYork,1986) [3]R.Baffi, G.Dolch, R.Garnick, Y.F.Huang, B.Mar, D.Matsuihiro. B.Niepelt, C.Parra, M.Stephan- A TOC Method for Validating Cleaning Between Products in Biopharm. Manufacturing-(Journal of Parenteral Science & Technology)[4] European Standard EN 1484-Water analysis -Guidelines for the determination of TOC and DOC [5] USP XXIII <643>Total Organic Carbon[6]Y.Egozy and J.P.Denoncourt-Trace level analyses of high -purity water,II.TOC-(Ultrapure Water)[7]W.Mertz.-Determination of TOC in potable water,sewage, industrial effluents, and boiler feed water-(Am.Lab.,8(12)29(1976)[8]C.D. Reach,Jr.and J.T.O’Conner "TOC and TOX as broad-spectrum parameters for drinking water qualitycontrol-(Proc.AWWA Water qual.technol.Conf:13,339/1986) [9]G.A.Crane –Selection of a TOC anlyzer-(Am. Lab20(7),51/1988) [10]R.Matsuda, M.Ishibshi, Muchiyama, T.Hiraoka, Y.kunihiro, H.Miki, Y.Nishimoto, K.Inazu, T.Mizuno, Watanable R., K.Yano-TOC as index for specification of Water for Injection-(J.Assoc.Off.Anal.Chem.,(70),681,1987 [11]ASTM- Standard Test Method for TOC in Water by UV,or Persulfate Oxidation, or both and Infrared Detection-ASTM Std D 4839-88 [12]Using TOC analysis to detect Organic contaminants in pharmaceutical water-OI Application Note-(presented at the 1994 PitCon on Anal.Chem. & Appl. Spectr:-Feb28 March4) [13]A comparison of TOC analysis method – Combustion versus Heated Persulfate (100°C)-OI Application Note presented at PittCon on Anal. Chem. & Appl. Spectr. [14] Scott M. Abeele – Private communication [15] Mike Retzik and P.Melanson -A second generation TOC Analysis Sistem for High-Purity Water System- (Ultrapure Water) April1995.[16] James Valdez, Stefen Stiller, Paul Melanson, Patrick Gallegos Chris Flint Measurement of Ultra-Low levels of Total Oxidable Carbon (TOC) in Water for Semiconductor Manufacturing Anatel Corp.Boulder Co.

 

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